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        蛋白質組學

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        糖基化蛋白質組學

        糖基化蛋白質組學

        • 所屬分類:修飾蛋白質組學
        • 瀏覽次數:
        • 發布日期:2021-01-18 19:04:58
        • 產品概述
        • 案例解析

        作為一種重要的翻譯后修飾,蛋白質糖基化它參與和調控生物體的許多生命活動。隨著蛋白質組技術的不斷發展,蛋白質糖基化研究越來越受到廣泛的重視。


        技術原理

        親水相互作用色譜(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)是基于富含多羥基的糖鏈結構的強親水特性,采用極性固定相和非極性流動相的色譜技術,利用了糖肽由于糖鏈的加入而增強的親水性,糖肽會有較長的保留時間,而使糖肽與非糖基化肽段得以分離的糖肽富集技術。HILIC對不同類型的糖肽沒有偏性,且能保持糖鏈結構的完整性,適合作為完整糖肽結構研究中的富集技術。單一的N-糖蛋白的位點鑒定,蛋白Trypsin酶解成肽段后,HILIC方法富集糖肽,N-糖酰胺酶(PNGase)切除連接在天冬酰胺殘基上的糖鏈(重水),再利用蛋白酶去除PNGase F,質譜分析。復雜樣本糖基化蛋白及修飾位點的確定, 是運用的Byonic法, Byonic搜索引擎能夠靈敏而全面的對肽和蛋白質進行鑒定, 其配套的PreviewTM軟件,可快速評估肽段質量誤差、消化特異性以及Byonic后續全面搜索的修改。

        糖基化蛋白質組學數據分析流程圖


        技術優勢

        1.相關領域專業技術支持;

        2.經驗豐富的實驗操作人員;

        3.獨立研發改進的具有技術的操作方法;

        4.動物植物多種案例經驗累積;

        5.強大的生物信息分析團隊。


        應用領域

        基礎醫學、臨床診斷:生物標志物,疾病機理機制,疾病分型,個性化治療等;

        生物醫藥:藥物作用機理,藥效評價,藥物開發等;

        微生物領域:致病機理,耐藥機制,病原體-宿主相互作用研究等; 

        海洋水產:漁業資源,海水養殖,漁業環境與水產品安全等;


        糖基化修飾蛋白組學案例解析


        SARS-CoV-2峰值的位點特異性聚糖分析

        Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike


        研究對象:SARS-CoV-2病毒S蛋白      期刊:Science

        影響因子:41.845                               發表單位:英國南安普敦大學



        研究背景

        新型冠狀病毒SARS-CoV-2(COVID-19的致病因子)的出現對全球人類健康構成了重大威脅。疫苗的開發集中在引起體液免疫反應的靶點,即刺突(S)糖蛋白,它介導細胞進入和膜融合。SARS-CoV-2 S基因編碼22個N-連接的糖基序列,可能在蛋白質折疊和免疫逃逸中起作用。該研究采用位點特異性質譜方法, 揭示了重組SARS-CoV-2 S免疫原上的聚糖結構,展示了SARS-CoV-2 S聚糖與典型宿主聚糖加工的不同之處,這可能對病毒病理生物學和疫苗設計有影響。

        樣本策略:純化的293F細胞重組的新冠病毒S蛋白

        技術策略:基于質譜的糖基化蛋白質組技術


        結果速遞

        為了解決SARS-CoV-2 S蛋白的位點特異性糖基化并可視化糖鏈異質體在整個蛋白表面的分布,研究人員表達純化了293F細胞重組的新冠病毒S蛋白,SARS-CoV-2 S糖蛋白的示意圖如下(圖1A)。利用尺寸排阻色譜法純化含有重組SARS-CoV-2 S的上清液,確保只分析天然的三聚蛋白(圖1B)。用電鏡負染對純化的三聚體構象進行驗證( 圖1C)。然后分別用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和A裂解蛋白酶將S蛋白酶解成肽段,每個片段包含一種N-糖基片段,使用質譜法確定每個位點的聚糖組成。

        圖1. SARS-CoV-2S糖蛋白的表達及驗證


        通過質譜方法測定出S蛋白上的22個N-糖基化位點( 圖2),其中18個糖基化位點在SARS病毒S蛋白中是保守的。研究人員發現S蛋白糖基化位點的糖鏈修飾分為寡甘露糖型、雜合型和復合型三種糖鏈類型,其中復合型糖鏈占比較高,不同糖基化位點的多糖種類和豐度差別較大。餅圖總結了這些多糖的定量。根據寡甘露糖型聚糖含量將其著色,標記為綠色(80?100%)、橙色(30?79%)和粉紅色(0?29%)的多糖位點。條形圖表示三個生物學重復的平均值,誤差條表示平均值的標準誤差。

        圖2. SARS-CoV-2 S糖蛋白的位點特異性N-糖基化


        研究人員利用S蛋白的電鏡結構,將糖基化狀態映射到了整個病毒S蛋白三聚體上, 揭示了N-糖基化如何在SARS-CoV-2 S蛋白整個表面上封閉不同的區域。結果表明SARS-CoV-2 S蛋白與其他病毒糖蛋白相比糖基化程度較低, 形成的“ 糖盾” 較少, 這有利于開發中和抗體。此外,復合型聚糖的處理是免疫原工程中的重要考慮因素。

        圖3. 基于結構的SARS-CoV-2 S N-連接的聚糖圖譜



        該研究對SARS-CoV-2的糖基化分析提供了天然折疊的三聚體刺突蛋白特有的位點特異性聚糖特征。隨著越來越多基于糖蛋白的候選疫苗的開發,其詳細的糖基分析為比較免疫原完整性提供了一條途徑,并且隨著生產規模擴大到臨床用途,對監測也很重要。因此,在血清學檢測試劑盒的生產中,聚糖譜分析也將是抗原質量的重要指標。最后隨著以核苷酸為基礎的疫苗出現,了解這些傳遞機制如何影響免疫原的加工和呈遞至關重要。


        參考文獻

        Watanabe Y, Allen JD, Wrapp D, et al. Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike[J]. Science, 2020, 369:330-333.

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